Fachbeiträge

NAW

Dünnschichtchromatographie - Nach der Normung ist vor der Normung

Nach der Normung ist vor der Normung

Neue Normungsaktivitäten zur Kopplung von Dünnschichtchromatographie und biologischen In-vitro-Testverfahren für eine wirkungsbasierte Bewertung von Umweltproben

Dr. Sebastian Buchinger, Dr. Georg Reifferscheid

Wasser ist Leben. Das Bewusstsein, dass wir Menschen durch unser Handeln eine der wichtigsten Ressourcen unseres Planeten belasten, hat bereits seit den 1970er Jahren zu einem schrittweisen Umdenken geführt. In der Vergangenheit lag ein Fokus stark auf der Minimierung von Nährstoffeinträgen durch Abwassereinleitungen und der Ausbau von Kläranlagen, was in Deutschland zu einer erheblichen Verbesserung der Situation führte. Der Arbeitsausschuss NA 119-01-03 AA "Wasseruntersuchung" ist in Deutschland das zentrale Gremium zur Normung und Verbreitung von chemischen und biologischen Verfahren zur Abwasserbewertung und leistet damit einen essentiellen Beitrag zum Gewässerschutz. Chemisch analytische Verfahren allein können aufgrund der Vielzahl eingetragener Substanzen abwasserbürtige Schadstoffe nicht vollständig erfassen. In diesem Bewusstsein sind in der deutschen Abwasserverordnung bereits seit jeher standardisierte Testverfahren zur summarischen Erfassung toxischer Wirkungen auf aquatische Organismen verankert.

Aktuell rücken anthropogene Spurenstoffe wie z. B. Arzneistoffe in das Blickfeld von Wissenschaft, Politik und Gesellschaft. Solche Spurenstoffe – beispielsweise hormonähnliche Substanzen – können durch ihre spezifische Wirkweise auch in geringen Konzentrationen schadhaft auf den Menschen und die Umwelt wirken. Diese Problematik adressieren auch politische Programme wie der EU-Green Deal und die europäische Biodiversitätsstrategie, die Umweltverschmutzung als einen wichtigen Treiber des zunehmenden Verlustes von Biodiversität nennen. Vor diesem Hintergrund ist es essentiell, dass für die Abwasserbewertung kontinuierlich geeignete chemische und biologische Methoden entwickelt, standardisiert und aktuell gehalten werden – daher: nach der Normung ist vor der Normung. Dieser Herausforderung stellt sich der der Arbeitsausschuss zur Wasseruntersuchung.

Ein Beispiel für eine aktuelle Normungsaktivität im Rahmen dieses Arbeitsausschusses ist die Standardisierung eines Verfahrens zur Kopplung von Dünnschichtchromatographie und biologischen In-vitro-Testverfahren, um östrogenartig wirkende Substanzen nachweisen zu können. Der große Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, sowohl substanzspezifische Aussagen - z. B. zum Kontrazeptivum 17alpha-Ethinylestradiol -  machen zu können, aber gleichzeitig alle weiteren, einschließlich völlig unbekannter Substanzen mit gleicher Wirkweise zu erfassen. Das Verfahren erfüllt Anforderungen der EU-Wasserrahmenrichtlinie hinsichtlich der analytischen Sensitivität, adressiert aber auch den Bedarf nach umfassenderen, wirkungsbasierten Ansätzen zur Bewertung von Abwässern und Oberflächenwässern. Zur Testdurchführung werden extrahierte Probendünnschichten chromatographisch getrennt und die Oberfläche der Dünnschichtplatte anschließend mit modifizierten Hefezellen besprüht. In Reaktion auf Substanzen, die den Östrogenrezeptor aktivieren, produzieren die Hefezellen innerhalb von drei Stunden ein Enzym, das sich durch einen Enzymtest – ebenfalls auf der Plattenoberfläche durchgeführt – nachweisen lässt. Auf diese Weise werden spezifische, östrogene Aktivitätsprofile einer Probe sichtbar gemacht. Ein Beispiel einer Untersuchung von Abwasser und Oberflächenwasserproben zeigt die folgende Abbildung. Oberflächenwasserproben oberhalb und unterhalb einer Kläranlage wurden unter Berücksichtigung der Fließgeschwindigkeit genommen und 1 000-fach angereichert. Zusätzlich wurde im Verlauf der Probenahme ebenfalls eine Abwasserprobe genommen und 200-fach angereichert. Die gewonnenen Extrakte wurden wie beschrieben untersucht. Dabei zeigten sich die dargestellten östrogenen Wirkprofile (Fotos der jeweiligen Plattenausschnitte links, Scans der jeweiligen Spuren rechts).

Abbildung: Abwassereinfluss auf östrogene Wirkungsprofile entlang eines Flussverlaufs. Quelle: Bundesanstalt für Gewässerkunde

Die Position von drei prominenten östrogenen Verbindungen (Estron (E1), 17alpha-Ethinylestradiol (EE2) und 17beta-Estradiol (E2)) nach der chromatographischen Trennung sind in der Abbildung markiert. In allen Proben zeigten sich Signale, die auf die Gegenwart von E1 und E2 hinweisen. In der Abwasserprobe ließ sich ein Signal detektieren, das der Substanz EE2 zugeordnet werden kann. In den Proben unterhalb der Kläranlage tritt dieses Signal jedoch nicht mehr auf. Bei einer 1 000-fachen Anreicherung wäre eine Konzentration von 10 pg/l EE2 mit dieser Methode nachweisbar. Neben den „üblichen Verdächtigen“ war die Gegenwart weiterer östrogenartig wirkender Substanzen in der Abwasserprobe nachweisbar. Ein entsprechendes Profil ließ sich 1 km unterhalb der Abwassereinleitung noch im Oberflächenwasser nachweisen. 10 km unterhalb der Einleitung zeigte sich ein gegenüber der Probe oberhalb der Einleitung unverändertes Wirkprofil. Die vorgestellte Methode ist ein robuster Ansatz zur Analyse von Proben mit einer anspruchsvollen Matrix wie beispielsweise Abwasserproben und bietet eine ausreichende Sensitivität zur Erfassung geringer Konzentrationen in Oberflächengewässern. Eine Bewertung der Ergebnisse kann stoffspezifisch erfolgen aber auch anhand der östrogenen Summenwirkung aller vorhandenen Substanzen in der Probe.

Zur Standardisierung dieses Verfahrens wird im Rahmen des Arbeitsausschusses NA 119-01-03 AA „Wasseruntersuchung“ im DIN‑Normenausschuss Wasserwesen (NAW) ein Arbeitskreis gebildet, der zunächst auf nationaler Ebene eine technische Spezifikation erarbeitet.

Im Anschluss soll eine internationale Standardisierung auf ISO-Ebene folgen sowie potenziell weitere Verfahren zur Detektion anderer Wirkmechanismen - z. B. gentoxische Effekte – in Kopplung mit der Dünnschichtchromatographie bearbeitet werden.

Dr. Sebastian Buchinger

Stellvertretender Referatsleiter „Biochemie und Ökotoxikologie“an der Bundesanstalt für Gewässerkunde

Leiter des Unterkomitees 5 „Biologische Methoden“ des ISO/TC 147 sowie Leiter der Arbeitsgruppe 12 „Querschnittsthemen der Ökotoxikologie“ in diesem Unterkomitee.

Dr. Georg Reifferscheid

Leiter des Referates „Biochemie und Ökotoxikologie“ an der Bundesanstalt für Gewässerkunde

Stellvertretender Abteilungsleiter "Qualitative Gewässerkunde"

Leiter der Arbeitsgruppe 9 „Hormonelle Wirkungen(Xenohormone)“

Designierter Leiter des SC 5 "Biologische Methoden" im ISO/TC 147